什么是離子交換色譜

利用分析樣品和填料中導入的離子交換基團之間的靜電相互作用的差異的分離模式。根據離子交換官能團的電荷不同，可分為陰離子交換色譜和陽離子交換色譜。陰離子交換色譜用填料中，導入了陽離子性的叔氨基或季銨基等；陽離子交換色譜用填料中，導入了陰離子性的磺酸基或羧基等。蛋白的靜電性質隨pH值的變化而發(fā)生變化。正負電荷正好平衡時，整體不帶電荷的固有pH值稱為等電點（表示為PI）。在更低pH值時，整體帶正電荷；更高pH值時，整體帶負電荷。見下圖。

pH 變化引起蛋白電荷狀態(tài)變化的示意圖

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因此在陰離子交換色譜中，用pH值略高于（+0.5至+1.0）等電點的流動相；在陽離子交換色譜中，用pH值略低于（-0.5至-1.0）等電點的流動相作為分離條件優(yōu)化的初始起點。

與填料靜電結合的分析樣品一般使用鹽濃度梯度洗脫法進行洗脫。增加流動相的離子強度（鹽濃度）時，靜電相互作用會逐漸減弱。當與離子交換基的靜電結合斷開時，分析樣品會在色譜柱內移動，如下圖。由于分析樣品不同，脫離填料時的鹽濃度也就不同。因此，樣品中等電點不同的組分就在不同時間被洗脫而分離開。由于蛋白的靜電性質隨pH值的變化而變化，因此，也可以通過改變pH值進行分離（稱為pH梯度洗脫法）。

蛋白離子交換反應的示意圖（陽離子交換）

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離子交換色譜具有分辨率高、吸附量大（載量高）等特點。并且，通過調整梯度洗脫的梯度，可以輕松調控或優(yōu)化分離。

氨基酸和電荷

由于構成蛋白的氨基酸具有酸性、堿性貨不帶電荷的側鏈，因此，蛋白本身的靜電特性也會隨著這些氨基酸組合的不同而變化。另外，由于末端存在未結合肽的羧基（C末端）和氨基（N末端），因此蛋白將始終顯示離子性質。

離子交換基團的種類

一般離子交換色譜用填料中，導入的離子交換基團的種類如下表所示。

離子交換基團的種類和構造

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交換基團不同，吸附特性、分離選擇性也不同。因此，選擇適合要進行測定的分析樣品的填料非常重要。因離子交換基團不同而造成的選擇性差異如下圖所示。下圖a中，三種蛋白在磺酸基型填料上獲得良好的分離；于此相對，使用羧基型填料時，細胞色素C和溶菌酶的洗脫峰接近，未能充分分離。另一方面，在下圖b中，三種蛋白在羧基型填料上均獲得了良好的分離；于此相對，使用羧基型填料時，胰蛋白酶原和核糖核酸酶A洗脫峰接近，未能充分分離。

不同離子交換基團的選擇性差異

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離子交換基團導入方法的差異

? ? 傳統(tǒng)的離子交換色譜用填料，一般在基質表面單純地導入離子交換基團。最近，出現了為增加吸附載量，導入緩慢交換的離子交換基團的方法（網狀化）以及在側鏈中引入具有離子交換基團的單鏈聚合物的方法（接枝聚合）等，如下圖。通過網狀化或接枝聚合化，可立體地導入離子交換基團，因為獲得更高的吸附載量。另外，通過立體導入，有時還可獲得不同的選擇性。

官能團導入方法及其性質